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DISCOVER-Seq检测脱靶CRISPR效应

2019-04-23 08:43:40 • 来源：

从一开始就困扰CRISPR-Cas9技术的一个问题是脱靶效应的可能性和未知效应 - 由CRISPR-Cas9编辑产生的DNA突变不在目标区域。为了理解脱靶变化的影响，必须首先检测它们。已经开发出一种新的普遍适用的无偏离靶识别方法。命名为DISCOVER-Seq(发现原位Cas脱靶并通过测序验证)，它利用细胞和生物中DNA修复因子的募集。

DISCOVER-Seq检测脱靶CRISPR效应

在加州大学伯克利分校，格拉德斯通研究所在旧金山，和阿斯利康的瑞典大学的创新基因组研究所(IGI)的工作，从小组，报道科学在标题的文件，“在CRISPR脱靶偏检测体内使用DISCOVER-Seq。“

“当CRISPR切割时，DNA被破坏，”IGI的博士后研究员，该论文的第一作者Beeke Wienert博士说。“因此，为了生存，细胞将许多不同的DNA修复因子募集到基因组中的特定位点，以修复断裂并将切割末端连接在一起。我们认为，如果我们能够找到这些DNA修复因子的位置，我们就可以识别被CRISPR切割的位点。“

研究人员研究了不同的DNA修复蛋白质鉴定化脓性链球菌的能力ChIP-Seq的Cas9靶位点。他们专注于MRN复合物的MRE11亚基，这是第一个被募集到切割位点的修复蛋白，被发现“紧密分布在Cas9切割位点周围。”作者写道“MRE11结合在出现之前达到顶峰插入和缺失(插入缺失)很容易在已知的指导RNA(gRNA)靶外检测到。“使用MRE11，DISCOVER-Seq可以鉴定出已经由CRISPR进行切割的基因组中的确切位点。大多数MRE11 ChIP-Seq读数在预测的Cas9切割时精确结束，从而能够以单碱基分辨率鉴定核酸酶位点。作者写道，“追踪MRE11的精确募集，揭示了单基因分辨率细胞中Cas活性的分子特征。”

“人类基因组非常庞大 - 如果你打印出完整的DNA序列，你最终会得到一本高达16层的小说，”格拉德斯通高级研究员，IGI副主任医学博士Bruce Conklin解释说。“当我们想用CRISPR切割DNA时，就像我们试图删除该小说中特定页面上的一个特定单词一样。”

“你可以将DNA修复因素视为书中添加的不同类型的书签，”康克林补充说。“虽然有些人可能会将整个章节加入书签，但MRE11是一个书签，可以深入到已更改的确切字母。”

目前存在检测CRISPR脱靶效应的不同方法。然而，它们具有从产生假阳性结果到杀死它们正在检查的细胞的限制。此外，迄今为止最常用的方法目前仅限于在实验室中用于培养细胞，不包括其在患者来源的干细胞或动物组织中的用途。

“因为我们的方法依赖于细胞的自然修复过程来识别切口，所以它已被证明侵入性更小，更可靠，”现任苏黎世联邦理工学院实验室的Jacob Corn博士说。“我们能够在诱导多能干细胞，患者细胞和小鼠中测试我们新的DISCOVER-Seq方法，我们的研究结果表明，这种方法可以用于任何系统，而不仅仅是在实验室中。”

DISCOVER-Seq适用于多种指导RNA形式和Cas酶类型。可以在细胞系和患者衍生的诱导多能干细胞中以及在小鼠的腺病毒编辑期间鉴定脱靶，为治疗性基因组编辑期间个体患者基因型内的原位脱靶发现铺平道路。通过应用于新的细胞类型和系统，DISCOVER-Seq还揭示了CRISPR用于编辑基因组的机制的新见解，这将有助于更好地理解该工具如何工作的生物学。

“这种新方法大大简化了识别脱靶效应的过程，同时也提高了结果的准确性，”康克林说。“这可以让我们更好地预测基因组编辑在临床环境中的运作方式。因此，它代表了改善临床前研究和使基于CRISPR的疗法更接近有需要的患者的重要一步。“

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