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使用新型LC-MS技术揭示褪黑激素生物合成途径

到目前为止,由于缺乏敏感和选择性技术,研究人员无法表征褪黑激素生物合成途径的阶段。褪黑激素途径中的七种合成中间体在结构和组成上都是高度多样化的,使得开发一种能够分析所有七种极具挑战性的技术。

使用新型LC-MS技术揭示褪黑激素生物合成途径

众所周知,褪黑激素参与植物的几个发育过程,并提供某种形式的保护以抵抗环境压力。但是,没有人知道这是怎么发生的。

先前的研究表明,液相色谱 - 质谱(LC-MS)与化学标记和同位素稀释技术相结合,可以提高褪黑激素通路分析的灵敏度和准确度。

基于这种理解,叶教授和武汉大学的团队开发了一种高灵敏度的LC-MS技术,可以分析所有七种褪黑激素中间体在稻穗和根中的分布。该研究有助于理解植物褪黑激素的生物合成以及它如何在应激反应中被调节。

一步式样品制备

Ye教授及其同事制定了一个准确的策略,能够同时分析七种植物褪黑激素代谢物:

色氨酸(Trp),

色胺(TAM),

5-羟色氨酸(5HTP),

5-羟色胺(5HT),

N-乙酰血清素(NAS),

5-甲氧基色胺(5MT),

和褪黑激素。

他们的方法使用一步分散固相萃取(DSPE)纯化和丹磺酰氯(DNS-Cl)标记与LC-MS结合。与其他技术不同,该方法高度灵敏,能够检测每种代谢物的变化,以响应非生物镉(Cd),这是一种环境压力因子。

研究人员发现,使用DSPE,然后使用试剂石墨化炭黑(GCB)简化并优化了样品制备过程,同时DNS-Cl标记提高了代谢物的电离效率。

后者提高了LC-MS分析的灵敏度,克服了与传统LC-MS相关的色谱分离差的问题。

两种途径,一种是压力反应

植物褪黑激素合成涉及两种主要的生物合成途径 - 途径I和途径II。两种途径是相同的,直到血清素为止,其中途径I通过酶ASTM1进行以产生5-甲氧基色胺(5MT),并且途径II通过SNAT1进行以产生N-乙酰基去甲素(NAT)。

利用他们高度敏感的技术,研究人员能够证明Pathway I在正常条件下占主导地位,而Pathway II则是在响应Cd胁迫时诱导的。然后,途径II控制大部分褪黑激素的产生。

为了进一步证明这种转录优势的转变,研究人员使用定量实时PCR(qPCR)来监测基因表达的变化。他们观察到水稻芽中的ASTM1增加了200倍,根系对压力的反应增加了200倍,这为他们的研究提供了支持。

样本数量“急剧减少”

这些发现虽然毫不含糊,但只能粗略地了解通路手术的遗传基础。如果我们要将这种途径用于农业,对褪黑激素合成途径的进一步分析将是至关重要的。

虽然以前的研究已经提出了一些途径,但是有利于它们发起和/或支配的机制和条件仍然不清楚。叶教授及其同事的工作提高了这种认识,证明了褪黑素生物合成调节对镉胁迫的反应。此外,拟议的策略将分析所需的植物样品质量减少到10mg,研究人员称“与先前的报告相比,所需的样品量显着减少”。

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