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如果破坏DNA修复 CRISPR-Cas9可以更好地打破基因

CRISPR-Cas9是用于敲除人类细胞系基因以发现基因功能的首选技术,但其禁用基因的效率可能会有很大差异。加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员现在已经找到了一种方法来提高CRISPR-Cas9在大多数类型的人类细胞中切割和禁用基因的效率达到五倍,从而更容易创建和研究敲除细胞系,并且可能会禁用突变基因作为人类治疗的一种形式。

如果破坏DNA修复 CRISPR-Cas9可以更好地打破基因

科学家们不断发现新基因或它们编码的蛋白质,但要弄清楚它们在体内或疾病中的作用要困难得多。发现这个角色的关键是禁用基因,看看它被移除后会发生什么。

虽然CRISPR-Cas9可以加速制造敲除细胞系的过程,但研究人员有时必须制作和筛选基因剪刀的许多变体以找到效果良好的基因剪刀。加州大学伯克利分校的研究人员发现,通过简单的调整,这个过程可以提高几倍的效率。

关键是将细胞DNA与CRISPR-Cas9蛋白质一起引入细胞中,这些DNA片段与人类基因组中的任何DNA序列都不匹配。称为寡核苷酸的短片DNA似乎干扰细胞中的DNA 修复机制,以提高甚至中等CRISPR-Cas9s的编辑性能在2.5倍和5倍之间。

“事实证明,如果你做一些非常简单的事情 - 只需喂养在人类基因组中任何地方没有同源性的廉价合成寡核苷酸 - 编辑率上升多达五倍,”首席研究员Jacob Corn说,科学主任加州大学伯克利分校的创新基因组学计划和分子与细胞生物学助理兼职教授。该技术提高了所有CRISPR-Cas9的效率,甚至是那些最初都无法工作的那些。

随着效率的提高,研究人员将更好地创造他们想要的敲除物,然后利用这些敲除细胞系来探索基因或一组基因的功能。因为大多数长寿细胞系来自癌细胞 - 包括非常流行的HeLa细胞系 - 这些细胞系通常具有超过每个基因的正常两个拷贝。这可能使得难以立即淘汰所有副本,并且更高的效率极大地增加了成功的机会。

当敲除基因以纠正人类的遗传性突变时,高效率也是必不可少的。医生们推测,敲除使人易患艾滋病等传染病的基因,或易患自身免疫,炎症或神经退行性疾病的基因。玉米及其同事描述的方法是否可用于治疗背景仍有待观察,但它对于研究目的非常有效。

结果将于8月17日在在线期刊Nature Communications上报道。

DNA修复是CRISPR-Cas9成功的关键

CRISPR-Cas9分子由蛋白质剪刀,Cas9蛋白质和一个告诉Cas9在哪里结合DNA并切割的地址组成。该技术依赖于以下事实:当您切割DNA时,细胞的修复机制并不总能正确地重建DNA链,而是在序列中产生错误,从而使基因失效并敲除其活性。

Tha地址称为指导RNA,是一串20个核糖核酸分子,与靶基因的DNA序列互补。该指导RNA与Velcro条带结合DNA,设置Cas9切割双链DNA。

为什么一些指导RNA运作良好,将Cas9设置为几乎100%的时间切割和禁用基因,而其他人绑定但很少或从未敲除基因,这是一个难题,因为该技术是由加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna发明的玉米说,切割效率因细胞类型和特定细胞系而异。切割效率因细胞类型和特定细胞系而异。

玉米怀疑Cas9的切割效率偶尔可能与DNA的修复方式有关,因为DNA修复机制 - 修复DNA中可能导致致命突变的任何断裂或缺失的基本管家酶 - 因细胞而异。他推断DNA的随机链 - 它们都不与任何实际的人类DNA相似(即非同源) - 可能会混淆修复过程并提高敲除成功率。

“它给细胞带来了一点力气,以防止正常的修复发生,”他说。

他将CRISPR-Cas9基因编辑描述为切割和DNA修复之间的竞争:一旦Cas9切割,细胞完全取代切割的DNA,Cas9再次切割,在无休止的切割和修复循环中,直到修复酶出错并且基因最终失去功能。他说,或许,寡核苷酸会降低修复过程的保真度,或者使细胞转换为更容易出错的修复,使Cas9更容易破坏基因。

他说,下一个前沿是试图利用DNA修复的特性来改善序列插入,以便用正常基因取代缺陷基因并可能治愈遗传病。

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