我们几乎没有开始破解基因组大量非编码区域的规则手册。基于CRISPR进展的两种新方法可能有助于揭示一些页面。我们对基因组蛋白质编码成分背后的规则有了合理的理解。我们可以看一下DNA序列，并自信地指出基因编码区的起始位置，结束位置以及地理位置。

对于剩余的98%的基因组 - 决定细胞读取哪些基因的部分 - 这是一个不同的故事。我们对管理这种“暗物质”的规则有什么了解，来自于一次一个地研究和操纵非编码DNA的各个位。然而，管理非编码基因组如何工作的规则手册仍然遥不可及。

“影响人类疾病的百分之九十的遗传变异都在非编码区域，”Broad创始主任Eric Lander说。“但我们没有办法以系统的方式告诉哪些监管机构影响哪些基因。”

在一篇新发表的科学论文中，Broad的两个研究小组展示了利用CRISPR基因编辑的方法如何帮助掌握这些规则。

使用两种互补的方法，团队 - 一个来自Lander实验室，另一个来自Broad Core Institute成员和McGovern脑研究所研究员Feng Zhang - 使用CRISPR作为工具系统地同时探测数千个非编码DNA序列(很多广泛的团体过去曾做过编码DNA)。在这个过程中，两者都确定了几个有趣的遗传调节因子，包括远离它们控制的基因的数百万个碱基。

“我们希望能够对控制每种基因在每种细胞类型中表达的非编码元素进行编目，”兰德实验室的博士后研究员，其中一篇论文的资深作者Jesse Engreitz说。“这是生物学中的一个大问题，它是将许多遗传关联与其基本分子机制和人类疾病联系起来的限速步骤。”

主题的变化

两个团队都使用汇集的CRISPR屏幕(使用称为Cas9酶的分子手术刀和数千个将Cas9靶向特定序列的指导RNA同时扫描和编辑大片基因组)来扰乱非编码DNA。但他们以不同的方式这样做。

Zhang，Neville Sanjana(张实验室的校友，现在是纽约基因组中心的核心成员)和Jason Wright(另一位张校友，现在是Homology Medicines)使用Cas9对重叠的非编码DNA进行精确编辑。在三种基因(NF1，NF2和CUL3)周围的区域中，其功能丧失与黑素瘤形式的耐药性有关。

“这种方法可以让我们诱发多种多样的突变，”Sanjana解释说。“我们不必推测给定序列如何最好被破坏。”

另一方面，Engreitz，Lander和研究生Charles Fulco使用CRISPR干扰系统，使用与称为KRAB结构域的蛋白片段融合的无活性或“死”形式的Cas9来沉默其靶序列(MYC和GATA1周围) ，两个重要转录因子的基因)。“这个系统提供了对给定非编码区域监管影响的良好定量估计，”Engreitz说。“它既可以显示控制特定基因的表盘，也可以告诉您每个表盘的重要程度。”

然后每个小组使用功能性读数(Sanjana，Wright和Zhang的黑素瘤细胞耐药性增加; Fulco，Lander和Engreitz细胞生长下降)和深度测序，以确定哪些指导RNA影响其基因表达感兴趣并绘制那些指导RNA受影响的监管机构。

通过一系列其他技术(例如，染色质分析，3D构象捕获，转录因子分析)证实了这两个团队的发现，指出了利用CRISPR工具追踪非编码基因组的调控布线的潜力。Fulco，Lander和Engreitz发现并评估了7种MYC和3种GATA1增强子(非编码DNA的短片，提高了基因被阅读的机会)的相对重要性。Sanjana，Wright和Zhang的屏幕仅针对CUL3精确定位了许多增强子和转录因子结合位点。

在自然栖息地研究序列

虽然原则上类似于传统的报告分析(科学家将有趣的序列与质粒中的报告基因偶联)，但这些合并的CRISPR筛选具有明显的差异：它们在其原生栖息地中直接探测序列。

“屏幕在其内生环境中询问序列，”Sanjana强调说。“报告分析可能非常有用，但它们缺乏天然基因组背景的3D构象或局部染色质环境。在这里，调控序列经历了所有正常的相互作用。”“例如，我们可以看到基因启动子和数千个碱基的非编码位点之间的远程环路，”他继续说道。“如果我们只是孤立地看待这些监管要素，我们就完全错过了这些有趣的3D互动。”

Engreitz指出，一个限制是，目前形式的CRISPR方法都不能解决基因组固有的冗余问题。“也许仅仅打破一个增强剂来真正了解基因是如何被控制的还是不够的。也许你必须打破一个以上，”他说。“我们还不能这样做。”

但Engreitz，Sanjana和Lander都对使用基于CRISPR的方法揭示非编码基因组的基本顺序的可能性持乐观态度。

“非编码基因组的一个有趣挑战是，虽然它非常庞大，但它内部的各个功能元素可能非常小，”Sanjana说。“在未来，重要的是要考虑如何开发新的方法来询问较大的区域，同时保持高分辨率。”

Engreitz同意并补充道，“当我们绘制更多这些连接时，我们将有可能学习规则，让我们可以预测非编码基因组的其余部分。”“这些方法使用指导RNA文库将CRISPR带入切割或引入抑制剂，让你直接看到大面积非编码DNA对不同基因的影响，”Lander说。“我认为这将破解开放的基因调控系统图。”